Stimulation du nerf vague par des électrodes de brassard nerveux périphérique implantées de manière chronique chez le rat

Résumé

Source : Sanchez, C. A., et al. Préparation d’électrodes de stimulation des nerfs périphériques pour une implantation chronique chez le rat. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo démontre la stimulation du nerf vague chez un rat éveillé. Un rat avec une électrode de brassard nerveux périphérique chronique implantée et entraîné à une tâche de pression à levier est connecté à un générateur de stimulus via un capuchon de tête implanté. Le nerf vague est stimulé immédiatement après chaque pression réussie sur le levier, ce qui entraîne l’expansion de la cartographie moteur.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Fabrication stimulante de l’électrode du brassard

1. Préparez le tube du brassard.
   1. À l’aide d’une lame de rasoir, coupez un morceau de tube en polymère de 2,5 mm de longueur. Insérez les pointes d’une pince ou un trombone dans le tube et utilisez la lame pour faire une fente dans le sens de la longueur à travers la paroi du tube d’un côté du brassard.
   2. Retirez la pince du tube et insérez une grosse aiguille à coudre dans la ligne médiane du brassard, perpendiculairement à l’axe long. Insérez l’aiguille à travers la fente (en haut) et au centre du tube en face (en bas). Placez l’aiguille dans le panneau de mousse pour épingler le brassard en place pendant les étapes d’assemblage restantes.
2. Placez une suture pour sécuriser la fermeture du brassard pendant l’implantation.
   1. Insérez la petite aiguille à coudre à travers la paroi du brassard, sur la ligne médiane, à environ 0,5 mm de la fente supérieure d’un côté. Insérez l’aiguille de l’intérieur vers l’extérieur pour éviter d’endommager le tube du brassard. Insérez une suture 6/0 de 2 cm de longueur dans le chas de l’aiguille et tirez l’aiguille à travers la paroi du tube pour enfiler la suture dans le brassard.
   2. En laissant le fil en place, retirez l’aiguille et percez un deuxième trou à travers la paroi du tube à environ 0,5 mm sous le premier trou, le long de la ligne médiane du brassard. Insérez la suture dans le chas de l’aiguille et tirez l’aiguille à travers la paroi du tube pour enfiler à nouveau la suture dans le brassard.
   3. Les deux extrémités du fil de suture doivent maintenant se trouver sur le côté extérieur du brassard. Ajustez la suture de manière à ce que ~1,5 cm s’étende du trou supérieur et ~0,5 mm s’étende du trou inférieur.
   4. Appliquez une petite quantité d’adhésif durcissant aux UV (ultraviolets) sur l’extrémité courte de la suture qui s’étend du trou inférieur et tirez sur l’extrémité la plus longue de la suture jusqu’à ce que la queue inférieure soit presque au ras de la paroi extérieure du tube. Utilisez la baguette UV pour durcir l’adhésif et maintenir la suture fermement en place.
   5. Répétez les étapes 1.2.1 à 1.2.3 sur le côté opposé du brassard.
3. Placez les fils conducteurs Platinum :Iridium (Pt :Ir).
   1. Utilisez la petite aiguille à coudre pour faire 4 trous dans la paroi de la manchette. Chaque paire de trous doit être placée à environ 0,5 à 0,8 mm de la ligne médiane perpendiculaire, avec un trou à environ 0,5 à 0,8 mm de la fente supérieure de chaque côté du brassard.
      ATTENTION : Pour un placement plus cohérent et plus précis des fils, insérez l’aiguille de l’intérieur vers l’extérieur pour faire tous les trous, en utilisant le placement de la suture comme guide.
   2. Insérez à nouveau l’aiguille à coudre, cette fois en travaillant de l’extérieur vers l’intérieur à travers le trou de plomb 1. Insérez environ 0,5 cm d’une longueur de 7,5 cm de fil Pt :Ir dans le chas de l’aiguille et tirez l’aiguille à travers le tube pour enfiler le fil à travers la paroi du brassard. Ajustez le fil de manière à ce qu’il s’étende sur le côté extérieur du brassard sur une longueur de ~4,5 cm (Figure 1A).
   3. Insérez à nouveau l’aiguille dans le trou de plomb 1, en travaillant à nouveau de l’extérieur vers l’intérieur, et insérez également l’aiguille dans le trou de plomb 2 directement en face du trou de plomb 1. Insérez ~0,5 cm de l’extrémité la plus courte (intérieure) du fil Pt :Ir dans le chas de l’aiguille et tirez l’aiguille à travers le tube pour enfiler le fil conducteur à travers les parois du brassard.
      REMARQUE : Les deux extrémités du fil Pt :Ir doivent maintenant se trouver sur le côté extérieur du brassard, et une boucle de fil est formée autour du bord de la fente et à travers le trou de plomb 1 (Figure 1B).
   4. Répétez les étapes 1.3.1 à 1.3.3 pour placer le fil Pt :Ir à travers les trous de plomb 3 et 4.
   5. À l’aide d’un briquet au butane, retirez soigneusement l’isolant d’une longueur de 5 à 6 mm à l’extrémité des fils Pt :Ir s’étendant du trou de plomb 2 et du trou de plomb 4.
      ATTENTION : Isolez soigneusement les extrémités des fils du reste de l’ensemble du brassard pour éviter d’endommager le brassard. Utilisez des outils pour maintenir les fils afin d’éviter les blessures.
   6. Alignez le fil nu à l’intérieur du brassard pour placer les fils à leur emplacement final. Pour ce faire, tirez doucement sur l’extrémité du fil Pt :Ir qui s’étend du trou 1 jusqu’à ce que la partie non isolée du fil affleure le trou 1. Répétez l’opération avec l’autre fil pour aligner l’extrémité non isolée du fil enfilé dans les trous de plomb 3 et 4.
   7. Appliquez une petite quantité d’adhésif anti-UV sur les boucles de fil sur le côté extérieur du brassard au niveau des trous de plomb 1 et 3. Utilisez la baguette UV pour durcir l’adhésif et fixer les fils en place.
   8. À l’aide d’une petite pointe de pipette, poussez les fils Pt :Ir non isolés contre la paroi intérieure du brassard. Une fois les fils en place, coupez les extrémités des fils qui s’étendent des trous de plomb 2 et 4 de manière à ce qu’environ 1 mm de fil dépasse de l’extérieur de la paroi du brassard.
   9. Pliez les extrémités de 1 mm du fil à plat contre la surface extérieure du brassard, en prenant soin de ne pas les raccourcir ensemble. Appliquez une petite quantité d’adhésif anti-UV pour couvrir uniquement les deux queues et durcissez l’adhésif pour sécuriser le placement du plomb et fournir une isolation électrique.
      ATTENTION : Il est important de couvrir entièrement les surfaces Pt :Ir exposées à l’extérieur avec un adhésif pour isoler les fils et éviter toute stimulation hors cible.
4. Fixez les fils Pt :Ir en place avec une fixation de suture.
   1. Retirez la grande aiguille avec l’ensemble de manchette du panneau de mousse. Insérez une longueur de 3 cm de suture 6/0 dans le chas de l’aiguille et tirez l’aiguille à travers le tube pour enfiler la suture dans le bas du brassard au milieu.
   2. Passez à la petite aiguille à coudre pour terminer l’enfilage de la suture pour la fixation de la sonde Pt :Ir. Insérez l’aiguille dans le même trou médian, en travaillant à nouveau de l’intérieur vers l’extérieur pour éviter la déformation du tube et des fils conducteurs. Insérez la queue extérieure de la suture dans le chas de l’aiguille et tirez l’aiguille à travers la paroi du brassard pour créer une boucle de suture autour du bord du brassard (Figure 1C).
      REMARQUE : Utilisez une pince et passez au microscope pour vous assurer que la suture est orientée le long de l’axe long du brassard et repose à plat contre le tube. Cette étape permet de s’assurer que les fils restent séparés à l’intérieur du brassard et sont maintenus en place latéralement à la ligne médiane du ballonnet.
   3. Créez une deuxième boucle autour de l’extrémité opposée du brassard en attachant les extrémités de la suture en un demi-nœud, sur le côté extérieur du brassard. Assurez-vous que la suture longe l’axe long du brassard et repose à plat contre le tube. Tout en maintenant le nœud bien serré pour qu’il repose à plat contre le tube, appliquez une petite quantité d’adhésif UV sur le demi-nœud et durcissez pour le maintenir en place.
   4. Coupez soigneusement les extrémités du fil de suture aussi près que possible du nœud. Si nécessaire, utilisez une petite quantité supplémentaire d’adhésif UV pour coller les extrémités courtes de la suture afin qu’elles reposent à plat contre le tube (figure 1D).
5. Soudez les broches du connecteur aux fils Pt :Ir.
   1. À l’aide d’un briquet au butane, retirez l’isolant de ~3 mm à l’extrémité de chacun des fils conducteurs Pt :Ir. Soudez le côté de la coupelle d’une broche en or (voir le tableau des matériaux) à l’extrémité non isolée de chaque son.
6. Testez l’impédance de l’appareil assemblé.
   1. Connectez les broches dorées aux entrées d’un LCR (Inductance (L), Capacité (C) et Résistance (R)) ou d’un module de vérification d’impédance d’électrode et réglez la fréquence de test à 1 kHz. Immergez le tube du brassard (et les contacts de stimulation Pt :Ir à l’intérieur du brassard) dans un petit bécher rempli de solution saline, en prenant soin de garder les broches en or et les connecteurs de sonde secs. Vérifiez que le brassard assemblé a une impédance à 1 kHz inférieure à 2 kΩ avant de procéder à l’implantation.
      REMARQUE : Une impédance élevée indique souvent une surface Pt :Ir insuffisante exposée, ce qui peut survenir en raison de facteurs tels qu’un retrait insuffisant de l’isolant, l’application accidentelle d’adhésif à l’intérieur du ballonnet, des brins de fil cassés, etc. Les brassards doivent également être inspectés pour détecter des brins de fil cassés ou mal placés qui pourraient entraîner des contacts courts-circuités en cas d’utilisation à long terme.

2. Construction du capuchon

REMARQUE : Les procédures d’assemblage du capuchon sont similaires à celles publiées précédemment et sont résumées ici pour plus de commodité.

1. Assemblez le capuchon
   1. Coupez deux petits morceaux de fil de 30 AWG (American Wire Gauge), un de ~13 mm de longueur et un de ~10 mm de longueur. Dénudez les ~1,5 mm d’isolant de chaque extrémité des deux fils. Soudez le côté broche d’une broche dorée à une extrémité de chaque fil, aussi près que possible de la coupelle. Utilisez des coupe-fils pour couper l’excès de longueur de la goupille au-delà du joint de soudure.
   2. Soudez les autres extrémités des fils AWG aux deux coupelles de soudure centrales d’un connecteur microruban à 4 broches.
   3. Pliez le capuchon du fil vers le connecteur et placez les broches dorées à plat contre le connecteur, parallèlement les unes aux autres, comme illustré à la Figure 2A. La broche connectée au fil le plus court doit être placée sous la broche connectée au fil le plus long. Utilisez de l’acrylique pour ongles, du ciment dentaire ou un adhésif à polymérisation UV pour fixer les fils du capuchon en place.

3. Utilisation de l’appareil

1. Implantez les électrodes du brassard pour la stimulation chronique du nerf vague.
   REMARQUE : Toutes les interventions chirurgicales doivent être effectuées à l’aide d’une technique stérile ou aseptique sous anesthésie appropriée, conformément aux directives des NIH (National Institutes of Health) pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et avec l’approbation locale de l’IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee). Les procédures suivantes ont pour but d’illustrer une utilisation représentative de l’appareil et ne sont pas exhaustives.
   1. Placez le rat dans un cadre stéréotaxique et faites une incision sagittale sur les os pariétal et occipital pour révéler la surface du crâne pour l’implantation de la coiffe/connecteur. Percez soigneusement 4 trous dans le crâne et placez les vis du bijoutier. Utilisez de l’acrylique dentaire pour fixer le capuchon au crâne et aux vis.
   2. Retirez le rat du cadre stéréotaxique et posez-le sur son côté droit. Faites une incision verticale dans la peau du côté gauche du cou et disséquez soigneusement le nerf vague gauche de l’artère carotide, situé entre les muscles sterno-mastoïdien et sterno-hyoïdien et sous le muscle omohyoïde.
   3. Le tunnel du brassard mène sous-cutané vers le crâne. Connectez les fils au capuchon à l’aide des goupilles dorées.
   4. Placez le nerf vague à l’intérieur du brassard et fixez l’appareil fermé en faisant un double nœud dans les sutures du ballonnet. Veillez à ne pas endommager le nerf lors de l’implantation en manipulant le nerf avec des crochets émoussés et non conducteurs ou en saisissant le tissu conjonctif entourant le nerf.
   5. Testez l’implant en appliquant une stimulation sur le dispositif (train de 10 s de 0,8 mA, 30 Hz, impulsions biphasiques de 100 μs). Une implantation correcte entraînera un arrêt de la respiration et une baisse de la SpO₂ (saturation en oxygène capillaire périphérique) de 5 % ou plus.
   6. Couvrez les broches dorées et les fils exposés avec de l’acrylique dentaire, fermez les plaies avec des sutures et nettoyez les sites d’incision avec une solution saline, de l’alcool et de la povidone iodée.
   7. Fournir des liquides de remplacement, des analgésiques et des soins postopératoires conformément aux directives du NIH et à l’approbation de l’IACUC.
2. Stimuler le nerf vague pendant le comportement éveillé.
   REMARQUE : Il a déjà été démontré que l’administration de VNS (stimulation du nerf vague) lorsque les animaux effectuent des tâches motrices spécifiques élargit la représentation de la carte motrice de la musculature pertinente à la tâche. Nous utilisons ce paradigme validé pour fournir un exemple représentatif de l’utilisation du dispositif, mais de nombreux autres paradigmes comportementaux et/ou paramètres de stimulation peuvent être pertinents pour d’autres applications. Les rats ont été entraînés à être compétents dans la tâche de presse à levier utilisée ici avant l’implantation du dispositif. Après l’opération, les bonnes performances ont de nouveau été vérifiées avant l’administration du VNS : les rats ont effectué au moins 100 essais réussis en deux séances d’entraînement de 30 minutes par jour. VNS a été associé à des presses à levier correctes lors de 10 séances d’entraînement ultérieures sur 5 jours.
   1. Connectez le rat à un générateur de stimulus via un capuchon de tête implanté et ajustez aux paramètres de stimulation appropriés. Pour la réorganisation de la carte corticale motrice induite par VNS, associez chaque pression de levier correcte à un seul train de 15 impulsions biphasiques, chacune d’une largeur de 100 μs et d’une amplitude de 800 μA, délivrée à une fréquence de 30 Hz.
   2. Un train de stimulation est délivré immédiatement après la détection de chaque pression de levier réussie tout au long de dix séances d’entraînement de 30 minutes. Pendant l’administration VNS, utilisez un oscilloscope pour surveiller la bonne distribution de la stimulation de courant.
3. Valider la fonction du brassard implanté de manière chronique.
   1. Dans les 24 heures suivant la dernière séance d’entraînement appariée VNS, utilisez la microstimulation intracrânienne (ICMS) pour quantifier la carte somatotopique fonctionnelle dans le cortex moteur.
   2. Après l’induction de l’anesthésie pour la cartographie ICMS du cortex moteur, valider à nouveau la fonction du brassard en appliquant un train de 10 s de stimulation de courant de 30 Hz, 0,8 mA (impulsions biphasiques de 100 μs), ce qui devrait entraîner un arrêt de la respiration et une réduction des niveaux de SpO₂ d’au moins 5 %, conformément au réflexe de Hering-Breuer.
      REMARQUE : Selon l’application, le fonctionnement du brassard peut être considéré comme acceptable si une baisse fiable de la SpO₂ inférieure à 5 % est observée ou si des amplitudes de courant plus élevées (jusqu’à 1,6 mA) produisent de manière fiable une réduction d’au moins 5 % de la SpO₂. L’absence d’observation d’un arrêt de la respiration et/ou d’une diminution fiable de la SpO₂ est indicative d’une défaillance de l’implant.

Résultats

Figure 1 : Assemblage des électrodes du brassard de stimulation. (A) Après avoir fixé les sutures de chaque côté du brassard, le fil Pt :Ir peut être enfilé à travers la paroi du brassard au trou #1 (pointe de flèche blanche) à l’ai...

Matériaux